Fondée en 1605, suite à l'échec de l'île Sainte-Croix, Port-Royal est située dans le bassin de la rivière Dauphin (rivière Annapolis), tout près de la baie Française (Baie de Fundy), en Nouvelle-Écosse. Port-Royal peut être considérée comme le premier véritable établissement permanent en Amérique du Nord, précédant de trois ans la fondation de Jamestown, en Virginie, colonie nommée en l'honneur du roi James. Cette colonie est, pour plusieurs, la première capitale de l'Acadie, territoire qui couvre aujourd'hui les provinces Maritimes et la côte est du Maine (États-Unis). En 1710, sous l'occupation anglaise, Port-Royal est définitivement devenue Annapolis Royal.

Après le dur hiver de 1605 passé sur l'île Sainte-Croix, les quelques survivants de la colonie accueillent avec joie l'arrivée de François Gravé Dupont et de ses deux navires remplis de provisions. Puis, en compagnie de ce dernier, Samuel de Champlain explore, pendant six semaines, la côte de la baie Française dans l'espoir d'y trouver un endroit plus propice à l'expansion de la colonie. Finalement, leur choix s'arrête sur un coin de terre ferme, à l'abri des intempéries et du froid. Ces terres appartiennent par contre à Jean de Biencourt de Poutrincourt qui, en explorant les alentours de l'île Sainte-Croix jusqu'à la baie de Fundy, en était tombé amoureux. À sa demande, Pierre Dugua de Mons les lui accorde, par amitié. C'est donc sur ces terres que Gravé Dupont et Champlain fondent alors Port-Royal. Avec l'aide des colons, ils y construisent une habitation fortifiée en utilisant certains matériaux provenant de celle de l'île Sainte-Croix. Ce genre de construction d'inspiration française de l'époque « faisait en sorte que les bâtisses pouvaient être démontables. » Lors du départ de Dugua pour la France, 45 hommes habitent déjà Port-Royal et s'apprêtent à y passer l'hiver. Ce premier hiver est éprouvant pour la colonie: douze résidants meurent.

Pour égayer le moral des colons, Samuel de Champlain fonde cette année-là en 1605 le premier club social de l'Amérique du Nord, « l'Ordre de Bon Temps » où les colons prennent charge des repas tour à tour et partagent le résultat de leur pêche et de leur chasse. La vie de la colonie est également très riche: musique, poésie, activité culturelle, etc. Même le théâtre a sa place et Marc Lescarbot est le principal responsable de ce secteur. Jeune avocat français, Lescarbot arrive en 1606 à Port-Royal avec Jean de Biencourt de Poutrincourt et y présente la première pièce dramatique d'Amérique du Nord intitulée Le Théâtre de Neptune.

En juillet 1606, Dugua et Poutrincourt sont de retour à Port-Royal en compagnie de 50 hommes (incluant Charles de Biencourt, Louis Hébert et Marc Lescarbot) et apportent avec eux des provisions. Poutrincourt en est maintenant le lieutenant-gouverneur. Dirigeant ses hommes d'une main de fer, il fait préparer et ensemencer la terre, construit un moulin à eau, une forge et des routes donnant accès aux champs, établit des relations amicales avec les Micmacs et le chef Membertou, développe le commerce de la fourrure. Il explore avec Champlain la côte nord du bassin des Mines. L'hiver de 1606 à 1607 est meilleur pour les hommes de la colonie, les récoltes leur assurant une meilleure alimentation, riche en vitamine C. La chasse au gibier et la pêche sont d'excellentes habitudes que les colons ont acquises en côtoyant les Amérindiens de la région.

Malheureusement, à l'automne 1607, la colonie est abandonnée: le roi de France enlève à Dugua son monopole de la traite de fourrures, n'ayant pas démontré sa capacité à coloniser la région. Sans ce commerce, Dugua n'a plus les revenus nécessaires pour financer la colonie; il repart donc en France avec tous les colons en 1607. Il demande à son ami, le chef Membertou, de s'occuper de l'habitation de Port-Royal, le temps qu'il renfloue ses coffres.

Il faut attendre 1610 avant que le roi de France accorde à Poutrincourt la concession seigneuriale de Port-Royal. À son retour, il s'aperçoit que l'habitation a été gardée intacte grâce aux bons soins du chef Membertou qui l'accueille les bras grand ouverts. En croyant s'attirer les faveurs des communautés religieuses et ainsi avoir une source de financement pour la colonie, Poutrincourt demande à Membertou et à sa famille de se convertir au christianisme. L'abbé Jessé Fléché les baptise. L'année suivante, deux jésuites arrivent à Port-Royal et dénoncent le mauvais travail de l'abbé. Ce différend occasionne des tensions entre les jésuites et les colons et met fin à l'aide financière apportée par le roi Henri IV. Poutrincourt doit donc se rendre de nouveau en France pour amasser des fonds. Malheureusement il aboutit en prison pour payer ses dettes et ses fils, Charles de Biencourt et Jacques, doivent s'occuper de Port-Royal en son absence. Pendant ce temps, les jésuites fondent, en 1613, un autre établissement à l'île des Monts-Déserts: à la colonie de Saint-Sauveur, on retrouve des prêtres, une trentaine d'hommes, des chèvres et des chevaux.

Port-Royal a été le théâtre de nombreuses batailles et conquêtes. Cela débute en 1613 alors que Samuel Argall attaque les colonies françaises, sous les ordres du gouverneur Dale, de la Virginie, les mettant à sac et brûlant les bâtiments. Saint-Sauveur est la première colonie assiégée puis vient le tour de Port Royal et de l'habitation de l'île Sainte-Croix. Les colons prennent la fuite dans les forêts des environs. De retour en Acadie en 1614, Poutrincourt constate la destruction de Port-Royal et que les survivants, craintifs, demeurent maintenant dans les bois avec les Micmacs. Il décide très vite d'abandonner la colonie et de repartir pour la France. Puis en 1621, William Alexander obtient du roi James I d'Angleterre, le contrôle de l'Acadie maintenant nommée Nouvelle-Écosse et établit une colonie écossaise en 1629 à Port-Royal. En 1636, quatre ans après la signature du traité de Saint-Germain-en-Laye, les Français reviennent à Port-Royal : 40 familles s'y installent et la colonie a maintenant un régiment de 300 soldats armés de 60 canons. En 1654, les Anglais s'emparent de nouveau de la colonie, mais ne sont pas intéressés à y installer des colons, ni des soldats; ils se consacrent au commerce des fourrures. Même si la France reprend l'Acadie en 1670 grâce au traité de Breda, elle perd totalement le territoire et Port-Royal au cours de la guerre de Succession de d'Espagne (1701-1714). Mal protégée, affaiblie par la peste, Port-Royal capitule une dernière fois en 1710 alors attaquée par 2 000 hommes et 36 navires. Annapolis Royal est née.